И получение химерных животных

Одним из перспективных направлений микроманипуляций на ранних эмбрионах является искусственное получение химер, или генетических мозаиков.

Понятие химера (греч.Chimaira) означает составное животное. Сущность биотехнологического метода получения химер заключается в искусственном объединении с помощью микрохирургических манипуляций эмбриональных клеток двух (и более) животных, относящихся к разным породам и даже видам. Таким образом, животные – химеры несут в одном организме признаки обоих эмбрионов, отличающихся между собой разными генотипами (рис. 9.10).

Принято считать, что успешная пересадка эмбрионов может быть осуществлена только между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, от овец к козам и наоборот, сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты по причине иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии, с применением следующих методов:

Рис. 9.10. Получение химер (генетических мозаиков)

Первый метод по получению химер основан на объединении бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный объединённый эмбрион состоял из равного числа бластомеров эмбрионов 2-8 родителей. Пересадку внутренней клеточной массы каждого донора (бластомеры) путём инъекции переносили внутрь бластоцисты реципиентов.

При этом общее число клеток колебалось от четырёх до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в перевязанные лигатурой яйцеводы овец до развития до стадии бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получали живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Второй метод по получению химер основан на слиянии клеточной массы двух или нескольких эмбрионов внутри одной зоны пеллюцида. Этим методом можно получать агрегационные химеры.Метод состоит в том, что 8-клеточные эмбрионы инкубируют в среде с протеолитическим ферментом, переваривающим оболочки яйцеклетки. Освобождённые от оболочек эмбрионы соприкасаются между собой, в результате чего их клетки сливаются иперемешиваются. Искусственное получение химер началось с середины 70-х годов (М. Ларен, 1976). В животноводстве известны искусственные химеры как внутривидовые, так и межвидовые.

В Германии получены агрегационные химерные животные после соединения половинок 5-6 дневных эмбрионов от коров-доноров швицкой и голштинской пород крупного рогатого скота. Из семи полученных телят у пяти отсутствовали признаки химеризма, а два сочетали в своём фенотипе характерную масть двух исходных пород – бурую и чёрно-пёструю.

Животные-химеры несут в себе признаки обоих эмбрионов, то есть являются потомками не двух, а четырёх родителей. В 1993 году такой четырёхродительский химерный телёнок был получен в результате слияния эмбрионов двух подвидов крупного рогатого скота Bos Taurus и Bos indicus. Но при иммунологическом анализе у него был обнаружен эритроцитарный антиген, характерный для подвида Bos Taurus.

В университете штата Калифорния получены химеры овцы пород рамбулье и финский ландрас (Дж. Батлер и др. 1985). Однако из 15 полученных ягнят только у 5 методом анализа групп крови подтвердился химеризм.

Свои особенности наблюдаются и при получении межвидовых гибридов. Межвидовые химеры – эмбрионы после пересадки эмбрионов приживляются лишь в 10% случаев. Примером получения межвидовых химер в животноводстве служат овцекозы, сочетающие признаки овцы и козы (К. Файл и др., 1994; С. Майнике-Тилмани, Б. Майнике, 1994).

Авторы отмечают, что химерные животные не передают потомству характерную для них генетическую мозаичность. Подобно гетерозиготным или гибридным животным у потомков происходит расщепление, в результате чего нарушаются ценные генетические комбинации.

Хотя химерные животные поддерживают ценные хозяйственно полезные признаки лишь на протяжении одного поколения в скотоводстве, они могут представлять большой практический интерес. Он заключается в создании животных, сочетающие важные хозяйственно-полезные признаки, как, например, мясную и молочную продуктивность, которые являются антагонистами и трудносовместимы в одном животном.

Все мы знакомы с античной мифологией, которая населяла мир странными животными. Облик этих причудливых существ составляли разные части тела льва, змеи, орла, козы, рыбы... Гиппокампы, грифоны, химеры, сфинксы и прочие звери плодились воображением древних людей, а сейчас доживают свой век в современных фэнтези. Свой вклад в неомифологию делает и таксидермист Эндрю Ланкастер. Мастер, живущий в Новой Зеландии, создает , соединяя зверей, птиц и кукол.

Химеры - это не только ценный мех выдумки древних греков, но и биологический термин. Странные животные с разными частями тела от разных родителей действительно существуют. Природа сопротивляется, так что вывести живую химеру с генетически разнородными тканями не так просто, как сделать ее чучело. Ну а экспериментировать с людьми ученым и вовсе никто не даст, а таксидермист Эндрю Ланкастер успешно заменяет человеческие части тела кукольными.

Эндрю Ланкастер (Andrew Lancaster) родом из Великобритании, но уже 14 лет живет в Новой Зеландии - стране, где вроде бы и так хватает забавных живых существ (кстати, таксидермистом он стал как раз после переезда). Ан нет, ко всему-то человек привыкает. Пару лет назад чучельник взялся соединять несоединимые виды и подарил человечеству много химер. С его легкой руки появились трехглавые куры, куклозайцы и летающие свиньи.

В Новой Зеландии будущий креативный таксидермист часто видел на обочинах дорог сбитых животных. Жизнь им уже все равно не вернуть, так пусть хотя бы их останки не гниют на трассе, думал Эндрю Ланкастер, сдавал назад и подбирал очередную находку. Зверушки поменьше помещаются в морозилке, «под мороженым и овощами», для более крупных готовится специальный раствор.

Эндрю Ланкастер работает смотрителем причала, так что занимается актуальными вопросами таксидермии только по вечерам и выходным. Часто зверушкам приходится подождать, пока у хозяина появится время для манипуляций с опилками, тряпицами и проволокой.

Проблем с защитниками окружающей среды у автора нет, ведь для своих творческих экспериментов он никого не убивает. Зато есть проблемы с благоверной: супруга не разрешает креативному таксидермисту превращать дом в кунсткамеру, так что свежесозданным химерам приходится побыстрее искать новых хозяев. Благо выдумки всегда в цене, и странные создания исправно находят покупателей на просторах Интернета.

Жительницу США Лидию Фэйрчайлд ожидал неприятный сюрприз, когда после развода она обратилась за социальным пособием. Ее мужу пришлось подтверждать отцовство анализом ДНК - и последний показал, что как раз Лидия не является матерью двоих общих детей (а заодно и третьего, которым она в это время была беременна). Сначала возникло предположение, что причина - пе­ресадка тканей или переливание крови, однако ни женщина, ни дети не подвергались.

Штат подал иск о мошенничестве. Положение спас адвокат миссис Фэйрчайлд - он предоставил суду статью из «Медицинского журнала Новой Англии»:

52-летней бостонской учительнице Карен Киган требовалась трансплантация почки. Трое ее сыновей согласились быть донорами, однако при генетическом анализе оказалось, что двое из них не родственники собственной матери! Исследования установили массу интересных фактов: в частно­сти, выяснилось, что у Карен была сестра- близнец, которая на ранней фазе эмбрионального развития слилась с выжившим зародышем. Бостонская учительница оказалась химерой - существом, в чьем организме присутствуют, не мешая друг другу, ткани с разными наборами генов.

В прецеденте с миссис Фэйрчайлд все оказалось еще сложнее - ДНК детей Лидии доказывало лишь родство с их бабушкой, матерью миссис Фэйрчайлд. Разобраться удалось лишь благодаря анализу волос, причем волосы на голове и лобке женщины содержали разный генетический материал. Миссис Фэйрчайлд вышла сухой из воды, а ее истории в 2006 году посвятили передачу «Мой близнец во мне».

Официально зафиксировано около сорока случаев химеризма, фактически же их гораздо больше. С высокой вероятностью химерой был знаменитый маньяк Чикатило, у которого не совпадали данные по группе крови и по сперме. Иногда химеризм случайно всплывает при попытках экс­тракорпорального оплодотворения или искусственной инсеминации: ученые из Германии описали пациентку, у которой в организме 99% клеток содержало женский хромосомный набор XX и 1% - мужской, XY. Как оказалось, ее брат-близнец умер при рождении, но его клетки жили в организме сестры.

И это лишь случаи, донесенные до широкой медицинской общественности.

Лапы, крылья и хвост

Термин «химера» взят из греческой мифологии - это «составное» чудовище с телом козы, головой льва, змеиным хвостом и т. д. Порождено оно уродливыми монстрами - полуженщиной-полузмеей Ехидной и великаном Тифоном, убито же, по одной из версий, героем Беллерофонтом. В биологии химера, как уже говорилось, - существо с разнородным генетическим материалом, сосуществующим в одном организме. Первым термин ввел в 1907 году немецкий ботаник Ганс Винклер, назвав химе­рами растения, полученные в результате прививки паслена на черенок томата. Объяснил природу явления другой ботаник - Эрвин Баур. А первое «сложносочиненное» животное было сконструировано в 1984 году - искусственная «мозаика» овцы и козы, детеныш четырех родителей, часть клеток которого содержала овечий геном, а часть - козий.

Химеризм у растений - результат природных мутаций или прививок, когда ветка растения одного вида подсаживается к стволу другого. Эксперименты Лютера Бёрбанка со знаменитым Russet Burbank, сортом картофеля, который сейчас составляет до 50% урожая картофеля в Соединенных Штатах Америки, бескосточковыми сливами и айвой с запахом ананаса в большинстве своем были созданием Франкенштейнов в мире растений.

Тем же занимался знаменитый Мичурин, который со всей обстоятельностью изучал, как влияет подвой (молодое растение, на которое подсаживают чужой черенок) на урожайность, жизнеспособность и другие свойства привоя. Реакция «трансплантат против хозяина», из-за которой столь опасны пересадки органов у людей и животных, растениям, в общем, несвойственна. Единственная сложность - зеленые химеры, как правило, не передают свои качества по наследству, размножать их приходится вегетативным путем.

Химеризм у млекопитающих может быть следствием нескольких процессов, как естественных, так и искусственных. Первый - так называемый тетрагаметический химеризм, когда воедино сливаются две яйцеклетки, каждая из которых оплодотворена своим сперматозоидом, или два эмбриона на ранних стадиях развития, вследствие чего разные органы или клетки такого организма содержат разный хромосомный набор. Истории с «поглощенным близнецом» - типичный пример такого химеризма.

Второй - микрохимеризм. Клетки младенца могут проникать в кровеносную систему матери и прижи­ваться в ее тканях (фетальный микрохимеризм). Например, иммунные клетки плода могут (во всяком случае на несколько лет) вылечить мать от ревматоидного артрита, помочь восстановить сердечную мышцу после развившейся во время беременности сердечной недостаточности или повысить сопротивляемость материнского организма онкологическим заболеваниям. И наоборот, клетки матери проникают через плацентарный барьер к плоду (материнский микрохимеризм). Не без его помощи формируется система врожденного иммунитета: иммунная система плода «натаскивается» на сопротивление болезням, иммунитет к которым выработался у матери. Оборотная сторона этой медали - то, что ребенок еще в утробе матери может стать жертвой ее собственных заболеваний. В частности, такое аутоиммунное заболевание, как волчанка новорожденных, часто встречается у детей, матери которых болеют системной красной волчанкой.

Третий вариант природного химеризма - «близнецовый», когда из-за сращения кровеносных сосудов гетерозиготные близнецы передают друг другу свои клетки (не с одинаковыми, как у гомозиготных, а с так же, как у родных братьев и сестер, различающимися наборами генов). Так стала химерой упомянутая выше пациентка из Германии.

Следующий вариант химеризма - посттрансплантационный, когда после переливания крови или пересадки органа в организме человека собственные клетки сосуществуют с клетками донора. Очень редко, но случается, что клетки донора полностью «встраиваются» в организм реципиента - так, несколько лет назад у одной австралийской девочки после пересадки печени навсегда изменилась группа крови.

Последний вариант - трансплантация костного мозга, при которой врачи прилагают все усилия, чтобы сделать из пациента химеру и заставить пересаженные клетки работать вместо хозяйских.

Собственный костный мозг больного убивают облучением и специальными препаратами, вводят на его место донорские кроветворные клетки и ждут. Если анализы выявляют донорский химеризм - все счастливы, процесс идет, а если удастся справиться с отторжением трансплантата, есть шансы на выздоровление. А вот возвращение «родных» клеток означает скорый рецидив болезни.

Лабораторные химеры

История химерных зародышей началась с бычков доктора Рэя Оуэна и цыплят доктора Питера Брайана Медавара, благодаря которым удалось разработать механизм химеризации.

Телята и цыплята Оуэн первым обратил внимание, что у телят-близнецов в организме прекрасно сосуществуют клетки с разнородным генетическим материалом, и причина тому - сращение кровеносных сосудов. А доктор Медавар сперва сращивал выпиленными в скорлупе «окошками» куриные яйца, затем ставил эксперименты по введению культур клеток уток в куриные зародыши, затем начал соединять кровеносные системы зародышей цыплят и, наконец, сформулировал термин «иммунологическая толерантность» - готовность организма принять чужие клетки. Он первым подсадил зародышам мышат одной чистой линии клетки зародышей другой, а затем пересаживал выжившим химерам лоскуты кожи, чтобы продемонстрировать: пересаженные биоматериалы сохраняют свойства родного организма и при этом не отторгаются. Ученые Чикаго и Ливерпуля сконструировали в лабораториях химеры лесных и домашних мышей, введя дополнительный генетический материал в зародыши на стадии бластоцисты.

Мышата оказались вполне жизнеспособными: более активными, чем домашние мыши, но менее активными, чем лесные. В России успешно выращивали куриных химер - белых леггорнов с рыжими хвостами родайлендов.

Игрушечные человечки

Еще один вариант создания химер - введение человеческой ДНК в яйцеклетку животного. Генетиче­ский материал цибридов - клеточных гибридов - практически полностью является человеческим, от животного они получают только митохондриальную ДНК. Правда, попытки довести гибридные эмбрионы до рождения химер на современном уровне науки обречены на провал; к тому же клонирование человека и тем более создание человеко-животных химер законодательно запрещены во всех развитых странах. Да и нет никакого смысла в таких сложных экспериментах. Несколько десятков цибридных эмбрионов, созданных с чисто исследовательскими целями, были уничтожены через несколько дней после начала деления яйцеклетки.

Доктора и гомункулы

Ученым понадобилось около двадцати лет (с момента первой успешной операции доктора Томаса), чтобы научиться подбирать доноров и реципиентов, совместимых по лейкоцитарным антигенам человека - белкам, несовпадение которых запускает каскад молекулярных реакций, приводящих к отторжению трансплантата, и бороться с отторжением с помощью препаратов, подавляющих иммунитет. К 1990 году было проведено около 4000 пересадок костного мозга - меньше, чем в наши дни проводится за год. Сейчас пятилетняя выживаемость (фактически - выздоровление) при остром лейкозе составляет 65%. Соответственно, появилась возможность наблюдать за неожиданными эффектами химеризма.

К тому, что после пересадки могут измениться группа крови, резус- фактор и структура волос, уже давно готовы и врачи, и родственники больных - но это отнюдь не все.

То, что пересадка костного мозга может излечить даже СПИД, - случайное открытие, везение немецких медиков. Известно, что около 1% европейцев устойчивы к ВИЧ. Некий 42-летний американец, страдающий и лимфомой, и СПИДом, прошел трансплантацию костного мозга, чтобы избавиться от одной из своих болезней. И неожиданно для всех (включая врачей) исцелился от обеих - его донор оказался носителем мутации, обеспечивающей устойчивость к вирусу, и передал ее реципиенту вместе с костным мозгом.

Ноу-хау XXI века - разработки по внутриутробной клеточной терапии. Стволовые клетки крови вводятся плоду, страдающему иммунодефицитом, талассемией, гранулоцитозом - и теоретически ребенок должен родиться здоровым. Практически удалось добиться эффекта лишь у плодов с иммунодефицитом, во всех остальных случаях даже при минимальном химеризме болезнь не отступала. На животных активно проводятся опыты по комплексной терапии: сперва «выключают» иммунитет плода, а затем проводят пересадку. Но до экспериментов на людях пока далеко.

Химеризм во благо

Медицина поставила возможности химеризма себе на службу еще до того, как это явление было изучено во всей полноте. В 1940 году была проведена первая попытка трансплантации больному апластической анемией костного мозга его брата. В 1958 году пересадкой костного мозга в Париже лечили шестерых югославских физиков, пострадавших при аварии на АЭС, пятеро из них выжили. В 1957 году в США доктору Эдуарду Томасу удалось (после тотального облучения тела) добиться приживления трансплантата у двоих детей, больных лейкозом. Дети вскоре погибли, а через 10 лет из 417 проведенных Томасом трансплантаций успешными оказались только три. В 1968 году была осуществлена полностью успешная трансплантация: ребенку с тяжелым иммунодефицитом ввели костный мозг его брата. Больной выздоровел, став химерой - вместо собственных клеток кровь в организме вырабатывали «братские». А Эдуард Томас в 1990 году получил Нобелевскую премию по медицине.

Новость отредактировал olqa.weles - 28-01-2012, 17:47

Химерами называют организмы или их части, состоящие из генетически разнородных тканей. Впервые этот термин применил немецкий ботаник Г. Винклер (1907) для форм растений, полученных в результате сращивания паслена и томата. В дальнейшем (1909) Э. Баур, изучая пеларгонию пестролистные, выяснил природу химер. Различают несколько типов причудливых организмов:

• · химеры мозаичные (гиперхимеры) - в них генетически разные ткани образуют тонкую мозаику;
• · химеры векториальни - у них разнородные ткани расположены большими участками;
• · химеры периклинальных - ткани с разными генотипами лежат слоями друг над другом;
• · химеры мериклинальни - их ткани состоят из смеси секториальних и периклинальных участков. Химеры могут возникать в результате прививок растений и под влиянием мутаций соматических клеток. Компоненты химер могут отличаться друг от друга генами ядра, числом хромосом или генами пластид или митохондрий. Причудливые организмы часто используются в научных исследованиях.

Принцип получения химер сводится главным образом к выделению двух или большего числа ранних зародышей и их слияния. В том случае, когда в генотипе зародышей, использованных для создания химеры, есть отличия по ряду характеристик, удается проследить судьбу клеток обоих видов. С помощью причудливых мышей было, например, решен вопрос о способе возникновения в ходе развития многоядерных клеток поперечнополосатых мышц. Изучение химерных животных позволило решить множество проблем, и в будущем благодаря применению этого метода появится возможность решать сложные вопросы генетики и эмбриологии. Получение таких эмбрионов осуществляется во многих лабораториях. Принцип получения химер сводится главным образом к выделению двух и большего числа ранних зародышей и их слиянию. В том случае, когда в генотипе зародышей, использованных для создания химеры, есть отличия по ряду характеристик, удается проследить судьбу клеток обоих типов.

Два метода получения химер: 1) агрегационный - объединение двух и более морул или бластоцист в один эмбрион; 2) инъекционный - микроинъекция клеток внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона-реципиента. Имеются внутривидовые и межвидовые химеры лабораторных животных и с/х животных. В потомстве химерных животных не сохраняется родительский генотип, происходит расщепление, и нарушаются ценные генетические комбинации.

Развитие генной инжинерии создало принципиально новую основу для конструирования последовательностей ДНК, необходимых исследователю. Успехи в области экспериментальной эмбриологии позволили создать методы введения таких искусственно созданных генов в ядра сперматозоидов или яйцеклеток. В результате возникла возможность получения трансгенных животных.

Трансгенные организмы

Трансгенными называют растения и животных, содержащие в своих клетках ген чужого организма, входящий в хромосомы. Их получают, используя методы генной инженерии. Трансгенные организмы могут иметь большое значение для повышения эффективности сельского хозяйства и в исследованиях в области молекулярной биологии.

Первые генетически модифицированные организмы, полученные с помощью методов молекулярной биологии, появились на свет только в 80-х годах XX века. Ученые сумели изменить геном растительных клеток, добавляя в них необходимые гены других растений, животных, рыбы и даже человека.

Первый трансгенный организм (мышь) был получен Дж. Гордоном с сотрудниками 1980 г. На начале 90-х годов в Китае было проведено первое коммерческое испытания генетически модифицированных сортов табака и томатов, устойчивых к вирусам. А в 1994 г. в США впервые поступили в торговую сеть продуктов питания плоды генетически измененных томатов с сокращенным сроком созревания.

В ряде экспериментов было установлено, что мыши, развивающиеся из зиготы, в которую была введена чужеродная ДНК, содержат в своем геноме фрагменты этой ДНК, а иногда у них происходит и экспрессия чужеродных генов.

Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена).

Создание трансгенных организмов используют:

• - в научном эксперименте для развития технологии создания трансгенных организмов, для изучения роли определенных генов и белков и биологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получили трансгенные организмы с маркерными генами
• - в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных;
• - в биотехнологическом производстве плазмид и белков.

В настоящее время получено большое количество штаммов трансгенных бактерий, линий трансгенных животных и растений. Близко по смыслу и значению к трансгенным организмам находятся трансгенные клеточные культуры. Ключевым этапом в технологии создания трансгенных организмов является трансфекция -- внедрение ДНК в клетки будущего трансгенного организма.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками.